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May 17, 2024

역전사

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 11470(2023) 이 기사 인용 9845 액세스 4 Altmetric Metrics 세부 정보 이 문서에 설명된 절차는 전사체의 새로운 방법을 나타냅니다.

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 11470(2023) 이 기사 인용

9845 액세스

4 알트메트릭

측정항목 세부정보

이 문서에 설명된 절차는 잠재적인 DNA 오염을 제거할 필요가 없는 PCR(중합효소 연쇄 반응)을 통한 전사체 분석을 위한 새로운 방법을 나타냅니다. 기존 방법에 비해 우리 방법은 RNA의 무결성을 보존하고 DNA 제거에 사용되는 재료 및/또는 시약이 필요하지 않으며 설정해야 하는 샘플 수를 줄여 더 정확하고 간단하며 재현성이 뛰어납니다. 부정적인 통제로 위로 올라갑니다. 이 새로운 절차는 역전사 단계에서 일치하지 않는 염기를 포함하는 특별히 변형된 프라이머를 사용하여 게놈 DNA와 다른 cDNA 분자를 생성하는 것을 포함합니다. PCR 증폭 시 동일한 변형된 프라이머를 사용하면 게놈 DNA 주형이 프라이머와 부분적으로 이종이므로 cDNA 주형만 증폭됩니다. 이러한 방식으로 PCR에 의한 증폭은 cDNA 템플릿에만 특이적이기 때문에 잠재적인 DNA 오염에 영향을 받지 않습니다. 또한 이는 DNA 제거를 위해 현재 방법론에서 일반적으로 사용되는 다양한 물리적 또는 효소 처리로 인해 변화하기 쉬운 샘플의 초기 RNA 농도를 정확하게 반영합니다. 이 방법은 위성 DNA와 같이 고도로 반복적인 DNA 전사체의 정량화에 특히 적합합니다.

PCR 증폭을 통한 전사물의 정성적 및/또는 정량적 분석은 분자생물학 연구와 의료 진단 모두에서 선택되는 방법입니다1. 이는 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 비코딩 RNA 등과 같은 다양한 유형의 전사체를 검출하고 정량화하는 데 널리 사용됩니다. 가장 일반적인 응용 분야에는 유전자 발현 분석 및 특정 미생물의 정확한 식별이 포함됩니다.

정제된 RNA를 적절하게 분석하기 위해, 정제된 RNA는 예비적이고 기본적인 역전사 단계를 거치며, 이를 통해 RNA 분자는 역전사 효소에 의해 cDNA(상보적 DNA)로 전환됩니다. 실제로 RNA 자체는 후속 PCR 단계에서 직접 증폭될 수 없으며 반드시 cDNA1로 변환되어야 합니다. 현재 가장 많이 사용되는 프로토콜의 주요 문제는 PCR 증폭 중에 중합효소에 의해 cDNA와 구조적 수준에서 화학적으로 구별하는 것이 불가능하여 위양성 결과가 발생하는 자주 존재하는 DNA 오염에 있습니다2,3,4,5, 6,7. 이러한 한계를 극복하기 위해 현재의 모든 프로토콜에는 RNA 정제 및 후속 역전사 단계 모두에서 두 가지 DNA 제거 단계가 포함됩니다. 두 경우 모두 특정 기계적 필터(실리카 기반 컬럼)를 사용하거나 DNase I(Deoxyribonuclease I)8과 같은 특정 효소에 의한 효소 분해를 통해 DNA가 제거됩니다. 그러나 이러한 치료법은 종종 DNA 오염으로 남아 있는 DNA 제거에 100% 효과적이지 않습니다2,3. 이는 진핵 생물 게놈의 상당 부분을 구성하고 종종 낮은 수준에서 전사되는 고도로 반복적인 DNA의 경우에 특히 그렇습니다. 더욱이, 샘플 내 DNA 농도를 감소시키기 위해 실행된 모든 절차는 본질적으로 불안정하고 쉽게 분해되는 분자인 RNA 자체의 초기 농도도 확실히 감소시킨다는 점을 강조해야 합니다.

여기에서는 cDNA와 DNA가 구별되어 후자에 의한 오염이 배제되어 보다 정확하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 결과를 생성하는 PCR을 통한 전사체 분석을 위한 새로운 방법을 보고합니다.

새로운 프로토콜을 테스트하는 데 사용되는 정방향, 역방향 및 수정된 프라이머는 표 1에 설명되어 있습니다. 수정된 특정 프라이머는 변경되지 않은 뉴클레오티드로 교대로 분포되고 프라이머의 3' 말단(표 1에서 굵은 글씨로 표시).