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Scientific Reports 13권, 기사 번호: 4241(2023) 이 기사 인용 424 액세스 2 Altmetric Metrics 세부 정보 코로나19 팬데믹의 일환으로 임상 실험실은 다음과 같은 상황에 직면해 있습니다.

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 4241(2023) 이 기사 인용

424 액세스

2 알트메트릭

측정항목 세부정보

코로나19(COVID-19) 팬데믹의 일환으로 임상 실험실은 테스트가 엄청나게 증가하여 검체 수집 시스템, 시약 및 직원 부족이 발생했습니다. 우리는 비용과 기술자의 시간을 최소화하기 위해 자체 수집된 식염수 가글 샘플을 활용하여 높은 처리량의 SARS-CoV-2 다중 중합효소 연쇄 반응(PCR) 테스트를 최적화했습니다. 이는 널리 사용되는 로봇 액체 처리기인 Hamilton STARlet에서 핵산 추출을 제거하고 시료 처리를 자동화함으로써 달성되었습니다. Hamilton STARlet의 소프트웨어 시스템으로 샘플 ID를 판독하기 위한 맞춤형 바코드 스캐닝 스크립트는 1차 튜브 샘플링을 허용하도록 개발되었습니다. 사전 냉동된 SARS-CoV-2 분석 반응 혼합물을 사용하면 분석 설정 시간이 단축되었습니다. 검증 및 실시간 테스트 모두에서 이 분석은 위양성 또는 위음성 결과를 생성하지 않았습니다. 검증 중에 테스트된 1060개의 샘플 중 3.6%(39/1060)의 샘플은 단일 유전자 양성이거나 내부 대조 실패 또는 액체 흡인 오류가 있었기 때문에 재테스트가 필요했습니다. 전체 처리 시간은 자동화된 워크플로에서 약간만 빨랐지만(185분 대 200분) 실습 시간이 76% 단축되어 잠재적으로 직원의 피로와 탈진을 줄일 수 있었습니다. 검체 자가 수집부터 자동화된 직접 PCR 테스트까지 설명된 프로세스는 인적 자원 및 시약 요구 사항 측면에서 의료 시스템의 전체 부담을 크게 줄여줍니다.

비인두 면봉 표본(NPS) 수집은 여전히 ​​SARS-CoV-21,2 진단 검출을 위한 최적의 표준으로 간주됩니다. 이러한 검체 수집 방식은 검체 채취 과정을 정확하게 수집하거나 감독하기 위해 전담 의료 종사자(HCW)가 필요하기 때문에 환자에게 불편함을 주고 자원 집약적이라는 단점이 있습니다. NPS 샘플링 성능이 좋지 않으면 부적절하거나 부적절한 샘플 수집으로 인해 위음성 결과가 발생할 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 코로나19 팬데믹 기간 동안 관리하기 쉬운, 바람직하게는 자가 수집을 통해 대체 샘플 유형을 적극적으로 모색했습니다. 타액은 검증된 최초의 비침습적 비NPS 샘플 유형으로 표준 NPS 표본 유형3,4,5,6과 유사한 성능을 갖는 것으로 확인되었습니다. SARS-CoV-2 바이러스는 이 매트릭스에서 72시간 이상 안정적이므로7 특수 수집 장치나 보존제가 필요하지 않다는 경험적 관찰을 통해 집에서 자가 투여 검체 수집을 수행할 수 있는 가능성이 열렸습니다. 광범위한 RNA 정제 과정 없이 타액을 RT-qPCR 분석 반응 혼합물에 직접 첨가하는 "추출 없는" PCR 프로토콜8,9의 개발로 이 샘플 유형의 임상적 수용성이 더욱 향상되었습니다5. 이로 인해 미국 연방의약국(FDA)은 응급 사용 승인(EUA) 규정에 따라 SARS-CoV-2 검출을 위해 타액 샘플과 타액 검사용 직접 PCR 프로토콜인 Saliva Direct10을 승인하게 되었습니다.

NPS 샘플링에 대한 단순화된 대안으로서의 타액의 이점에도 불구하고, 높은 처리량의 SARS-CoV-2 검출을 위한 실제 구현은 진단 실험실에서 어려운 것으로 입증되었습니다11. 조타액은 점성이 있어 수집 직후 응고될 수 있습니다6. 이로 인해 수동으로 피펫팅하거나 자동화된 액체 처리기에서 피펫팅하기가 어렵습니다. 점도를 낮추려면 특정 완충액4,12,13에서 희석하거나 Proteinase-K5와 함께 인큐베이션한 다음 열처리(95°C에서 30분간)하여 단백질 제거제를 비활성화하는 등 개별 단계가 필요합니다. 이러한 사전 분석 단계는 구현이 간단하지만 수동으로 수행해야 하므로 임상 실험실에 추가적인 작업 부하가 부과됩니다. 이를 완화하기 위해 범용/바이러스 수송 매체(UTM/VTM)와 같은 액체 매체에서 타액을 수집하는 것이 제안되었습니다14. 그러나 이러한 액화/안정화제의 억제 특성으로 인해 원래의 Saliva Direct 프로토콜을 구현하기가 어려워 진단 실험실에서 표준 RNA 정제 방법15,16,17을 사용하여 타액 샘플을 처리해야 합니다. 이 테스트 경로는 시간이 많이 걸릴 뿐만 아니라, 특히 자원이 부족한 환경에서 SARS-CoV-2 테스트를 저렴하게 만들려는 Saliva Direct 프로토콜의 원래 목표에 위배됩니다.

 4 years old) while preserving their performance when compared with HCW collected NPS20,21 This freed up clinical resources and saved NPS collection devices, which were in critically short supply at the time22. Further studies showed saline gargle was also amenable to extraction-free PCR, but unlike saliva, did not require complex pre-analytical processing due to its water-like consistency23,24. The simplicity of this process opened up the possibility of automating the testing process on a liquid handler. The goal of the present study was therefore to describe the optimization and implementation of the Spike/ORF8/RNaseP (SORP) multiplex PCR test to the gargle Direct-PCR (GDirect-PCR) format on an automated liquid handling platform—the Microlab STARlet (Hamilton Robotics, NV, USA) liquid handling system, henceforth referred to as Hamilton GDirect-PCR (HGDirect-PCR)./p> 65 °C (Fig. 1). This suggested that the PCR annealing temperature of 60 °C, set in the original SORP version 1 assay for purified RNA templates, was not optimal for saline gargle templates used in direct-PCR conditions. When RNA was extracted from saline gargle samples and used as a purified template, both the S/ORF8 targets amplified optimally at 60 °C (Fig. 4_suppl) and any departure from this temperature (> 60 °C), resulted in a gradual decrease in the detection signal of both these targets. This suggested that the performance of the spike gene target was influenced by both the temperature and nature of input template (purified RNA vs unpurified saline gargle). The ORF8 amplification was not affected by the type of input template but an, increase in temperature from the optimal 60 °C did result in dampening of the amplification signal (Fig. 4_Suppl)./p> 98% analytical sensitivity26. We also noticed poor performance of our original S/ORF8 assay where random dropout of the S gene target was observed on the GDirect-PCR workflow. However, this was addressed when the assay was re-optimized (SORP version 2). We would like to also add that, due to frequent mutations observed in the S-gene (https://covariants.org/), there could be possibilities of observing S-gene dropouts (S-/ORF8+). Getting this result would invariably lead to excessive burden of additional confirmatory testing as per our testing algorithm (Fig. 3). Under such circumstances, the most prudent remedial measure would be to perform a detailed in-silico analysis of the S-gene’s primer/probe set and implement any potential modification(s) to its sequence./p>